本文要点：荧光引导手术需要近红外荧光团的发展。吲哚菁绿(ICG)应用广泛，临床记录安全，但其在nm处的最大吸收波长较短，因此需要利用较长波长的染料来发挥其低光*性和深渗透的优点。在这里，作者团队报道了一种稳定的深近红外(NIR)荧光染色支架ECY，它在CH2Cl2中吸收/发射/nm，荧光量子产率为16%。对ECY进行了更合理的生物分布的特异性设计。合成了类似的含不同数目的磺酸基或聚乙二醇链。通过对BALB/c小鼠静脉注射的重点文库进行筛选，发现ECYS2是肝胆排泄器官生物成像的合适候选者，ECYPEG是血管成像的最佳候选者。它们在术中成像中具有一定潜力。ECY是一种在nm处吸收的明亮荧光团，量子产率为16%，具有超光稳定性。其对肝脏、胆囊、胆管或肠道的生物分布特异性已通过分子工程实现。
生物成像光谱区域正向较长波长的方向转变。对于小动物的体内成像或术中成像，组织穿透深度是首要考虑的问题。为了避免背景组织被血红蛋白和含氧血红蛋白吸收，要求在nm以上的光下进行实验。穿透深度进一步受到组织散射的限制，其与波长的四次方成反比。目前的基准近红外荧光团是IndocyanineGreen(ICG)。它已广泛应用于临床背景下的眼底血管造影术、肝功能评估和荧光引导手术。体内成像需要深入到超过nm的长波长区域，即深近红外。对于这种深近红外光谱区域，需要一种多功能、明亮、生物相容性和生物分布特异性的荧光团。
近红外活性物质种类繁多，有机荧光团因其较高的临床转译潜力尤其受欢迎。ICG所属的聚甲基花菁是20世纪30年代首次报道的最著名的一类长波长染料。它们在有机溶剂中表现出较窄的吸收带和较高的摩尔吸光度。然而，花菁，特别是吸收波长超过nm的花菁，越来越容易发生极性/聚集诱导的对称性破坏，从而导致其S0-S1吸收带的峰移、带宽和低色移。这些光谱变化即使不阻止高对比度多路复用的潜力，也会使其复杂化。
DAD/ADA型荧光染色支架是近红外染料家族的新成员。它们的吸收带通常较宽(FWHMnm)，摩尔吸光度较低。年，我们报道了一类新的近红外荧光团，即EC5，其第一个体现是在CH2Cl2中吸收nm的明亮深近红外荧光团(ECX)。它的吸收强度高，吸收锐利，其吸收/发射最大值受溶剂化变色的影响最小。多年来，nm激光线在近红外生物成像中越来越受欢迎，而ECX在nm的吸收是最小的(图1)。
为了解决这个问题，作者团队计划开发一种易于被nm激发的EC5衍生物。由于显像剂的结构/生化特异性是外科医生最关心的问题，因此需要对其生物分布进行系统研究。生物相容性是体内成像的另一个至关重要的参数。理想情况下，它需要是水溶性的，易于代谢/排泄，*性最小。
图1（ICG和ECX的吸收光谱显示它们在nm处不明显吸收，以及ECY的通用结构）
在这项工作中，作者团队设计并合成了一种在CH2Cl2中吸收nm的明亮荧光团ECY。为了得到ECY的水溶性类似物，作者团队进一步安装了不同数量的磺酸基，即不含ECYa，含1个ECYS1，含2个ECYS2，含3个ECYS3，或平均分子量为amu的聚乙二醇链，即ECYPEG。评价了它们的光物理性质和激发态动力学、稳定性、急性*性、代谢和生物分布。最后，作者团队研究了它们在体内生物成像中的可行性。
随着n-取代基给电子能力的降低，罗丹明染料的波长会发生蓝移。因此，作者团队将ECX的juloliine取代基改为二乙胺，从而得到了具有蓝移波长的染料ECY。ECY的合成方法与ECX类似(方案1)。
方案1：ECYa-d及其水溶性类似物（ECYS1，ECYS2，ECYS3，ECYPEG）的合成过程。
在不同溶剂中检测了它们的光谱特性(图2和表1)。ECYa在CH2Cl2中的吸收光谱是典型的聚甲基花菁，在nm处有一个主波段，在nm处有一个肩带(图a)。它在-nm的整个可见范围内的吸收很弱，在nm、nm和nm处有三个峰指。激发后，ECYa在nm处发射最大(Φ?16%)，在nm处有尾峰。ECYa的光谱性质表现为溶剂致变色，但程度不显著。其吸收最大值在甲苯中蓝移nm，在CH3CN中蓝移nm，在DMSO中红移nm，在中性磷酸盐缓冲液(PBS,10mmol/L,pH7.4，含10%DMSO)中红移nm。ECYS1的水溶性实际上比ECYa差，而ECYS2和ECYS3具有较高的水溶性(10mg/mL)。之后获得了ECYS1在CH2Cl2、ECYS2和ECYS3在HEPES缓冲溶液(10mmol/L,pH7.4,0.1%DMSO)中的光谱(表1)。
图2.紫外-可见吸收，（A）ECYa，（B）ECYS1，（C）ECYS2，（D）ECYS3，（E）ECYPEG的荧光发射光谱。它们的化学结构以插图形式包括在内。这些吸收和发射光谱被进一步去卷积，组成带被绘制在相应的光谱下方。ECYa和ECYS1溶解在CH2Cl2，ECYS2，ECYS3和ECYPEG溶解在HEPES缓冲液中。（F）ECYa在CH2Cl2和水介质中的吸收光谱比较。
表1
总的来说，它们的吸收光谱保持了菁的特征，与ECYa的吸收光谱基本相似。观察到约10nm的轻微峰移和约cm2/15nm的带宽。溶剂致变色的不显著性归因于这样一个事实，即磺酸基安装在二苯醚或底部苯基上，它们在电子上与荧光致变色核心正交。
ECYPEG在HEPES中具有高水溶性，在nm处吸收，在nm处释放。根据之前报道的方法，将CH2Cl2中ECYa的光谱拟合到由8个构成高斯峰的数学模型中，即a1,a2,a3,a4,a5,a6,a7和a8的最大波长递减。在较长光谱区域(-nm)的峰a1,a2,a3和a4可能是从最低振动水平S0到较高振动水平S1的HOMO-LUMO跃迁。在-nm波长较短的区域，从较低的已占轨道到LUMO轨道的跃迁，共识别出a5、a6、a7和a8四个波段。花菁染料表现出一个尖锐而强烈的主带和一个不那么尖锐和低强度的肩带。以ECYa为例，这两个峰分别为a1和a3，FWHM′分别为cm-1和cm-1。作者认为，四个波段(a1:a2:a3:a4)的振子强度(f)对整个光谱的贡献百分比可以作为评价染料的一个可行的定量指标。
ECYa的花菁度为63:4:14:2。当溶解在HEPES(10mmol/L,pH7.4，添加0.5%ten-80)中，ECYa的花菁光谱特征保持不变，但峰a1和a3都略有变宽，FWHM分别为cm-1和cm-1(图F)。在58:5:21:4时，四个波段的贡献百分比基本相同。ECYS1在CH2Cl2、ECYS2、ECYS3和ECYPEG在HEPES中的吸收光谱(图2)B-E)同样是反卷积的。a1波段宽度分别为cm-1,cm-1,cm-1和cm-1，贡献率分别为62%、54%、55%和58%。
用自制的带有近红外CCD相机的外显荧光显微镜对这些ECY染料的光稳定性进行了评估。将ECYS2/ECYS3/ECYPEG/ICG溶液分别置于含10%血清的PBS中，滴在玻片上，用盖玻片密封。在nm激光激发下，用长通滤波器在nm处获得ICG/ECYS2/ECYS3/ECYPEG的荧光强度。ICG的荧光强度在几秒钟内下降了约79.6%，而ECYPEG没有表现出明显的漂白。无论它们的头基和取代基如何，都表现出良好的光稳定性。由于ECYS1的水溶性较差，因此未测试其光稳定性。
图3.ECYS2、ECYS3、ECYPEG和ICG在含有10%血清的PBS中的光稳定性研究，通过连续nm激光照射密封在载玻片和盖玻片之间的溶液进行。
作者团队筛选了用于生物分布的不同取代的ECY染料的聚焦库，即ECYa，ECYS2，ECYS3，剂量为1mg/kg和ECYPEG，剂量为3mg/kg。ICG常规用于手术中的脉管系统成像，并用作参考。然而，其快速的肝胆清除是一个实际的限制。在作者的实验中，ICG（1mg/kg）通过尾静脉注射到BALB/c小鼠中。用nm的激光照射小鼠，并通过截止波长为nm的长波通滤光片收集荧光发射。在短短2分钟内，肝脏的信号强度已经比颏下静脉高1.7倍，比右大隐脉管系统高3.5倍。在1小时内，脉管系统中ICG的发射不再明显。在接下来的几个小时里，小强度和盲肠依次亮起，突出了其肝胆清除途径和通过粪便排泄。通过监测肝脏和后肢脉管系统中ICG的荧光强度，计算出血液循环和肝胆清除率的半衰期分别为6.4±0.2分钟和.3±14.9分钟。尾静脉注射ECYa，ECYS3和ECYPEG时也清楚地观察到小鼠脉管系统，但ECYS2除外，因为它的肝脏摄取快。与ICG相比，ECYa（1mg/kg）表现出改善的血液潴留，这在前两小时内拍摄的图像中很明显（图4A）。来自脾脏的信号强度变强，包括胸骨和胫骨在内的骨骼也被点亮，可能是由于免疫原性相互作用。在12小时内，在肝脏，肠道和脊柱中仍然可以看到排放。其血液保留半衰期为35.6±7.7分钟。发现排泄主要通过网状内皮系统，排泄半衰期为.8±93.5分钟，是整个系列研究中最慢的。ECYS2（1mg/kg）的生物学分布和药代动力学与ICG相似，即肝脏快速摄取，血液保留半衰期短，为2.4±0.7分钟，排泄快。
一个有趣的发现是，在注射后2-4小时内，胆囊与周围组织形成高对比度染色。因此，它还显示出在肝移植期间进行术中胆管造影以避免胆管医源性损伤的潜力。与其他几种染料相比，ECYS3（1mg/kg）在前10分钟内产生最亮的脉管系统信号强度。然而，由于两个原因，它不是一个好的候选人。首先，它的生物清除速度很快，甚至比ICG还要快。其次，它表现出意想不到的皮肤亲和力，这解释了更明亮的信号强度。来自皮肤的强烈信号实际上使深部组织脉管系统的观察变得困难。ECYS3的血液循环时间为18.6±1.4min，肝脏吸收后排泄更快，排泄半衰期为60.5±10.9分钟。ECYPEG（3mg/kg）表现出强大的脉管成像能力。在前2分钟内，ECYPEG点亮了精神下，腹部和后肢脉管系统等，肝脏摄取程度相对较低，其中平均信号仅比1.9倍强右隐脉管系统的比率分别为3.5、3.3、7.4和1.9。在接下来的3h中，尽管脑和后肢脉管系统中的信号强度逐渐降低，但突出显示的血管的信噪比（SBR）保持在最大值的一半以上，而注射ICG后几乎没有荧光信号可见。计算血液保留半衰期为.5±34.8分钟，排泄半衰期为.1±19.7分钟。
图4.（A）在不同时间点用nm激光线（nm长通滤光片，50ms）静脉注射ICG，ECYa，ECYS2，ECYS3和ECYPEG后仰卧位小鼠的NIR荧光成像。（B,C）ICG，ECYa，ECYS2，ECYS3和ECYPEG给药小鼠肝脏和右隐脉管系统的代表性荧光强度作为时间的函数。（D）清醒小鼠的呼吸频率（每分钟次呼吸），通过检测静脉注射ECYPEG（1nm长通滤光片，5ms）后肝脏运动的荧光信号波动进行分析。所有图像均使用nm激光线（mW/cm）获得。
通过比较肝脏中的荧光强度，亲脂性ECYa的代谢和排泄最慢，ECYPEG的代谢和排泄速度第二慢（图4B）。所有磺酸盐衍生化类似物的代谢速度都快于ICG。为了比较它们的血液保留，外推后肢脉管系统的荧光强度（图4C）。ECYPEG是最持久的。其信号在注射后的前30分钟内逐渐增加，然后在ca内保持稳定。随后缓慢下降前30分钟。ECYPEG用于通过视频速率成像监测小鼠呼吸（图4D）。计算呼吸频率为次呼吸/分钟。研究了ECY染料的细胞活力，并且所有染料的细胞*性都可以忽略不计。最有希望的候选者（ECYPEG）和次佳候选者（ECYa）被送去用小鼠进行急性*性研究。发现ECYPEG在高达mg/kg的最高测试剂量下没有表现出急性*性，而LD50ECYa的14.7±1.8毫克/千克。ECYPEG的生物相容性进一步证明了良好的肝功能和器官组织学。根据血液保留半衰期、肝胆清除半衰期和生物相容性，选择ECYPEG进行进一步研究。
作者团队进一步优化了ECYPEG更高SBR的成像参数，同时展示了肢体和大脑中更细血管的概念验证脉管系统成像。将ECYPEG静脉注射到小鼠尾部，在nm激光线激发下，用不同截止波长的长波通发射滤光片收集荧光信号。使用0nm的长波通和1nm（1ms），（5ms），nm（20ms），nm（50ms），nm（ms），0nm（ms）的曝光时间获取了一系列图像（图5A）。一个普遍的趋势是，更长的截止波长导致较少的组织散射程度，改善SBR（图5D）和空间分辨率，但以牺牲曝光时间为代价。在后肢脉管系统的成像过程中也发现了相同的趋势（图5B-E），其中可以明显观察到FWHM为71.1μm的血管（图H）。曝光时间和SBR之间的折衷导致确定为nm/50ms用于未来的成像研究。
图5.通过尾静脉注射ECYPEG对BALB/C小鼠进行体内成像。（A）全身成像，依次用0、1、、、、0nm的长波通发射滤光片进行。比例尺：1厘米。（B）用1、、1和nm的长波通滤光片对后肢血管进行荧光成像。比例尺：2毫米。（C）使用1nm长波通滤光片进行脑脉管系统成像。比例尺：分别为2毫米、1毫米、0.5毫米。（D）图中突出显示的腹部（绿线）和后肢（红线）血管的信噪比（SBR）。5A.（E）图5B中突出显示的血管的SBR（F，G）图5C1-C2中脉管系统沿蓝线的相应SBR。（H）横截面荧光强度分布（黑点）和高斯在图5C3中适合其直径的红线。所有图像均使用nm激光线（mW/cm2）
讨论：作者团队进一步使用ECYPEG从上视图对大脑脉管统的微小血管通过完整的颅骨进行成像，激发波长为nm，长通截止波长为1nm，曝光时间为ms，放大倍率为0.64。静脉注射ECYPEG（3mg/kg）后，可以清楚地区分与SSS相连的脑下静脉（ICV）、横窦（TS）、上矢状窦（SSS）和浅静脉（SV）。较短的曝光有利于高成像帧速率，而较长的曝光时间可改善SBR。例如，为了实现更丰富的脉管系统网络观察，曝光时间设置为毫秒。在ms的曝光下，通过两个毛细管的线轮廓（以蓝色突出显示，图5C），计算出SBR为1.11和1.16（图5F）。通过增加到ms，获得1.22和1.26的SBR（图5G）。3倍的更高放大倍率和毫秒的曝光时间提供了更高的空间分辨率。用良好的SBR观察到表观宽度仅为6.3μm的微血管（图5）。
综上所述，作者团队在CH2Cl2中开发了一种明亮的深近红外荧光团(ECY)，吸收/发射波长为nm,FWHM窄至cm-1。通过引入不同数量的磺酸盐(ECYS1、ECYS2和ECYS3)或聚乙二醇链(ECYPEG)，作者团队进一步合成了一个ECY水溶性的集中库。在活体小鼠成像中进行了测试。ECYS2具有肝胆代谢器官成像的潜力，ECYPEG具有血管成像的潜力。这项工作为未来发展用于深近红外多路复用的荧光团提供了一个框架。此外，该工作的荧光团在基础研究、转化医学和外科手术中具有广泛的实际应用潜力。
参考文献
Dong,Y.;Lu,X.;Li,Y.;Chen,W.;Yin,L.;Zhao,J.;Hu,X.;Li,X.;Lei,Z.;Wu,Y.;Chen,H.;Luo,X.;Qian,X.;Yang,Y.,Spectralandbiodistributionalengineeringofdeepnear-infraredchromophore.ChineseChemicalLetters.
