今天韦翰斯生物带大家解读一篇关于铁硫簇生物发生蛋白(HSCB)基因突变引起先天性铁粒幼细胞贫血(CSA)的研究文献。
先天性铁粒幼细胞贫血(CSA)是一系列由红系细胞(erythroidcells)中异常铁离子积聚导致的罕见遗传性血液疾病，可由线粒体铁硫簇(Fe-Scluster)生物发生过程中的原发性缺陷引起。由于红系线粒体通常位于细胞核的周围，异常积聚的铁离子开始在核周围积聚环绕，最终会形成具有代表性的“环状铁粒幼细胞(ringsideroblast)”。HSCB蛋白(heatshockcognateB)是一种与线粒体HSPA9蛋白(mitochondrialheatshockproteinA9)、GLRX5蛋白(glutaredoxin5)一同作用促进铁硫簇合成的线粒体分子伴侣蛋白。
本文发表在JournalofClinicalInvestigation，作者在先前有关CSA致病机制的研究主要集中在HSPA9和GLRX5的基础上，提出共同参与铁硫簇合成的HSCB也与CSA关联的假说并对其进行了全面的验证。本次实验流程总共分为4个板块，首先对基因型尚未明确的CSA患者进行基因检测，找到HSCB相关基因突变的先证者；然后针对K红白血病细胞进行了短发夹RNA(shRNA)敲除实验，探索了HSCB水平降低对于红细胞系的影响；接着在斑马鱼胚胎中对HSCB基因使用Morpholino技术(Mo)进行敲低实验，研究了HSCB异常导致贫血症状的机制；最后作者针对四种不同的HSCB缺陷型小鼠（包括对HSCB基因进行敲除以及植入转基因系）以研究低HSCB水平在活体哺乳动物中造成的整体影响。
注释：
①人红系白血病k细胞年由KitamuraT等建立，源于一名35岁日本男性的肝素化骨髓抽取样本，该患者具有严重的全血细胞减少症。该细胞不表达血型糖蛋白A和碳酸酐酶I。由该细胞的形态和细胞化学特征及珠蛋白基因的组成性表达，显示该细胞属于红系，人红系白血病k细胞只用于科研，并不用于临床治疗。
②反义吗啉寡核苷酸技术Morpholino是斑马鱼中最为常见的一种基因敲降技术，其基本原理是把核苷酸上的五碳糖用吗啉环取代，并对原有的磷酸基团做一定的改变。该分子类似物一方面能够通过碱基互补配对的方式与单链结合，另一方面由于结构的变化而不带有任何电荷，不被任何酶识别，从而保证很强的稳定性。
本次实验的主要目的是为了探究HSCB基因异常与本文中出现的双突变型先证者所患CSA之间的关联，作者尚未对详细的致病机理进行深入的研究，而是结合多个结论得出了HSCB和CSA之间的因果关系，个中细节还有待之后的研究进一步探索。
Part1：CSA携带者筛查-检测关键基因位点
作者用一代测序和WES测序对例CSA患者进行检测，发现了一位双等位基因HSCB突变的CSA患者：她携带有基因组聚合数据库中尚未记载的移码变异(NM_.4,c.dup/p.Thr87Asnfs*27)以及一个罕见的启动子变体(c.–GA/rs;gnomADminorallelefrequency9.69×10)。发生移码变异的HSCB转录出的mRNA要么是无意义的、要么编码着一段被过早截断的并缺乏DNA_J结构域的非功能性蛋白，因此无法正常与HSPA9互动，这对铁硫簇聚合酶(ISCU)的影响尤甚，这在先前的研究中已经出现过所以不再赘述。另一处变异位于人类CD34血红素干细胞DNase敏感位点的启动子，是本文的研究重点——作者提出其极有可能干扰HSCB的转录过程从而引发一系列的CSA症状。
首先，作者使用GenomatixMatInspector软件来测定启动子突变区域潜在的转录因子结合位点，发现该变异扰乱了E26转录特异性DNA结合因子(ETS)结合位点的关键序列。那么ETS与HSCB之间的关联是什么呢？接着作者就对ETS1——红系细胞造血过程中最为常见的ETS之一进行了染色质免疫沉淀实验，证实了ETS的存在的确对HSCB的转录启动过程起着决定性的作用。随后对患者成纤维细胞的Westernblot测试中发现其中的HSCB水平比正常情况低75%，由此可见该突变的影响之大。
Part2：K细胞shRNA敲低-诱导分化
以往的对于哺乳动物细胞中HSCB蛋白的研究都在非造血、非幼红细胞系的细胞中开展，这忽视了一个严重的问题：幼红细胞系细胞有一套独特的铁稳态、血红素生物发生以及铁硫簇聚合的机制；而HSCB蛋白的缺失会影响红白血病细胞的氧化磷酸化、铁离子代谢和血红蛋白化，为了弄清HSCB在红细胞体系中的具体作用，作者对未分化的和分化了的K红白血病细胞进行了shRNA敲低实验。
实验中的第一步将HSCB的水平调整至与患者成纤维细胞中相仿（低于正常值75%），此时并未影响HSPA9基因的表达，但的确降低了含铁硫簇的线粒体酶如FECH和ACO2，以及包含铁硫簇亚单位的多聚呼吸复合体(RC)的表达。接下来的第二步为了对HSCB消耗红细胞特异性表型进行一个延时性的评估，作者将K细胞暴露在丁酸钠96小时进行诱导分化，发现HSCB的降低会导致FECH和K的胎儿血红蛋白表达受损——这些结果与从患者身上发现的HSCB水平降低导致低色素性小细胞性贫血一致。
Part3：斑马鱼胚胎HSCB敲低-注射编码ALAS2的mRNA
为了进一步探索HSCB在红细胞系中的作用，作者先观察了HSCBmRNA在斑马鱼胚胎中的表达过程，然后对HSCB进行Mo敲低实验。结果发现进行基因敲低的胚胎在体格上大致正常，但是血红蛋白化过程明显减少，相应地红细胞也不多。与HSCB敲低的K细胞相仿，血细胞特异性转铁蛋白受体的表达在吗啉基敲低的胚胎中表达有所上调，代表着IRP的活跃；而IRP活跃是缺铁或细胞质铁硫簇缺乏的标志，在由于铁硫簇缺乏导致5-IRE被抑制的目标mRNA中，包含着生成δ-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)的红细胞同种型ALAS2，ALAS2的水平降低。此时，IRP的活跃以及ALAS2表达被抑制都有可能是导致上述贫血症状的成因，那么到底谁是主要成因呢？
为了探索其中具体细节，作者选取了编码与IRP活跃高度相关的铁响应元素IRE(iron-responsiveelements)以及ALAS2的基因片段作为实验对象，将编码野生型ALAS2（正常）、5′-IRE突变ALAS2（无IRE）以及过早终止并同样缺失5′-IRE的ALAS2（无IRE和ALAS2）的mRNA注射进了Mo敲低的斑马鱼胚胎中。发现只有5′-IRE突变ALAS2（无IRE但有ALAS2）的一组表型有所减轻，代表着部分HSCB异常的贫血症状可以归因于一个ALAS2-IRP依赖型机制。
Part4：HSCB基因敲除-HSCB植入Epor-Cre/Vav1-Cre-HSCB植入Mx1-Cre
在实验的最后一步，为评估HSCB缺失在活体哺乳动物中的影响，作者首先敲除了小鼠的HSCB基因；然后分别在其他组别中植入了Epor-Cre/Vav1-Cre/Mx1-Cre转基因系嵌合体，可以表达重组酶。
基因敲除的小鼠胚胎均于7.5日前死亡，证明HSCB基因种系缺陷在小鼠胚胎的早期发育中是致命的。植入了Epor-Cre重组酶的胚胎(HscbEpor-Cre)均于14.5日前死亡，在11.5日前可以观测到类似于CSA患者铁粒幼细胞性贫血中环状铁粒幼细胞的现象。
相对而言植入了Vav1-Cre重组酶的小鼠胚胎(HscbVav1-Cre)存活了下来——不过出生后不久便表现出生长发育迟缓以及肤色苍白的表型，大部分于出生后的第4到第7天死于细菌性肺炎。解剖发现产后7日的Vav1-Cre型小鼠脾脏萎缩、骨骼颜色苍白，骨髓、肾脏和脾脏中造血细胞极少，这都是严重的全血细胞减少症症状。以上的结果证明了HSCB在小鼠正常的红细胞生长和应激造血反应中有着普遍性的关键作用。
最后，为了探索HSCB蛋白消耗的延时性影响，作者将两种小鼠受精后14.5天的胎肝造血干细胞：一种包含可诱导的转基因Mx1-Cre重组酶(HscbMx1-Cre)，另一组中不包含；移植到了同类型的野生型受体小鼠体内并培养8周，之后隔天注射聚肌苷-聚胞苷酸诱导Cre重组酶表达，然后跟踪定量和定性血液学参数观察3周。诱导重组酶表达后的第五天开始时，植入干细胞的小鼠的外周血中出现了铁细胞群并于第七天达到峰值；此后RBC计数、血红蛋白、WBC计数和血小板计数急剧下降，导致大多数小鼠无法存活到22天。后续分析发现小鼠骨髓中几乎不存在造血细胞，脾脏中也没有红系祖细胞。这表明HSCB蛋白耗损对持续的或应激的红细胞生成会造成巨大的影响，HSCB表达异常的小鼠会因无法正常生成血细胞死亡。
作者通过对四个不同细胞系的实验与观察——包括源自患者的或诱导突变的，证实了实验中每种变异都会降低HSCB的表达，从而引起铁硫簇生物发生、细胞呼吸和红细胞生成和分化的障碍；尤其是对于斑马鱼HSCB变体胚胎和HSCB缺陷型小鼠的研究更是突出体现了HSCB对红系细胞生成的关键作用，并且还可以诱导红细胞中铁离子的积累。这一系列的结论提供了强有力的证据，证明HSCB突变是导致文中所述患者铁粒幼细胞表型的原因；至此，HSCB和已经被证实的HSPA9和GLRX5一样，确定为线粒体铁硫簇相关的CSA基因。
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