地中海贫血（简称“地贫”）是最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病之一，依据不同的致病基因，分为α和β地中海贫血两种。其分子机制为珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍，使形成血红蛋白四聚体的α链／非α链比例失衡，进而引起红细胞破坏，造成溶血性贫血。地中海贫血属于罕见病，但发病地区并不均匀，在我国北方少见，但在广东、广西、四川等地多见，尤其是广东地区，平均每9个广东人就有1人携带了地中海贫血致病基因。如此高的携带率和潜在发病率，给社会和家庭带来了沉重的负担，成为严重的公共卫生问题。地中海贫血患者由于珠蛋白基因缺陷而导致血红蛋白中一种或者多种珠蛋白链合成障碍，进而表现为贫血等病理状态。缘于基因缺陷的复杂性与多样性，使缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大，因此，地中海贫血的种类也比较多，β-地中海贫血是其中的常见类型。β地中海贫血是危害最为严重的血红蛋白病，也是目前世界上最常见的遗传性疾病之一。临床上按照贫血严重程度，可以分为轻型、中间型和重型，轻型多数无明显症状；重型患者常在出生后即可有贫血表现，并伴随着头大、眼距增宽等特殊的面容改变；中间型患者的表现介于重型和轻型之间，患者发病稍晚。重度β地贫患者在出生后出现进行性贫血，需要进行终生输血和除铁治疗，在我国每年的治疗费用在10-20万元左右。由于血源紧张加上费用高昂，我国绝大多数病人无法接受规范治疗，平均存活年龄也仅在10岁左右。正常情况下，人体在胎儿期主要依靠γ珠蛋白与α珠蛋白形成胎儿血红蛋白四聚体（HbF），到成年后β珠蛋白开始表达而γ珠蛋白基因逐渐沉默。然而大量研究发现，很多β地贫病人中由于携带其他突变，造成γ珠蛋白基因（HBG）在成年仍然激活，高表达的γ珠蛋白能替代缺失的β珠蛋白与α珠蛋白形成HbF，而使病人不表现出明显的贫血症状。因此，通过在成人红细胞中激活胎儿期的HBG表达，弥补β珠蛋白表达不足，是治疗β地贫的重要策略之一。年1月8日，华东师范大学李大力和刘明耀教授团队同海医院马燕琳教授以及广西医院赖永榕教授合作，在CellResearch杂志发表了题为Reactivationofγ-globinExpressionthroughCas9orBaseEditortoTreatβ-Hemoglobinopathies的研究论文。该研究证实了通过CRISPR/Cas9或者单碱基编辑技术，高效编辑HBG1/2启动子上的BCL11A结合位点，能够重新开启β地贫患者细胞内γ珠蛋白的表达，显著改善患者红细胞的成熟，有望成为治愈β地中海贫血的基因治疗手段。有研究显示，在一部分重症β地贫患者中，天然携带着HBG启动子区域-~-位的缺失，这部分患者β地贫的症状很轻或者几乎没有症状。最近的研究显示，该区域正是转录抑制因子BCL11A的结合位点。MitchellJ.Weiss课题组通过慢病*递送CRISPR/Cas9系统的方法，从概念上证明了该靶点确实可以提高HBG表达，但是递送方法和效率都无法达到临床应用的要求。利用Cas9RNP电转的方式在造血干细胞中可以实现非常高效的编辑，是目前最有效的转导方式之一。本研究通过体外电转Cas9/sgRNARNP的方法，在该启动子区域的编辑效率均值达到了85%以上，并且基因编辑本身对细胞的*性较低。经过编辑以后，细胞内的γ珠蛋白在mRNA水平以及蛋白水平都得到了显著的提升。更重要的是，这些经过编辑的患者造血干细胞在诱导红系分化后，表型得到了明显的改善，它们在脱核率、细胞大小和细胞形态上都趋近于正常人的细胞。然而，野生型Cas9切割DNA双链引发NHEJ修复从而破坏目的片段，但DNA双链断裂始终是一个风险因素，而单碱基编辑方法几乎不引起双链断裂，有望克服这个潜在风险。该研究首次尝试了通过单碱基编辑的方法直接破坏BCL11A在HBG启动子上的结合位点，并且成功达到了约20%的总体碱基突变效率，在对实验细胞总体mRNA进行检测后，经过单碱基编辑的细胞中HBG基因的表达量同样得到了显著的提高。图1.在β地贫患者造血干细胞中实现高效、低*的基因编辑，重激活HBG表达综上所述，该研究成功地建立了具有临床转化价值的造血干/祖细胞基因编辑技术体系，通过电转Cas9RNP高效编辑HBG启动子，为重症β地贫患者提供了有望彻底治愈的新方法。同时，本研究率先证明单碱基编辑器编辑技术对于治疗β血红蛋白病的可行性与有效性，后续研究将进一步提高该位点的单碱基编辑效率，为临床应用提供更安全的策略。据悉，华东师范大学王立人，李林夕和海医院的马燕琳为本文共同第一作者，广西医院赖永榕、华东师范大学李大力、刘明耀为本文共同通讯作者，医院血液科付斌主任等参与了本项研究工作。
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