白癜风皮肤健康普查 http://pf.39.net/bdfyy/bdfrczy/171021/5779538.html红细胞(RBCs)是哺乳动物中大多数循环细胞的组成部分，对呼吸作用至关重要。红细胞通过组织运输，在循环中接触病原体和自源性炎症介质，使它们成为器官之间的理想信使。进化保守的核酸敏感Toll样受体(TLRs)识别来自自身和病原体的核酸，并通过促进炎症细胞因子分泌、免疫细胞成熟和增殖在炎症中发挥核心作用。含CpG的游离DNA水平升高是感染和无菌损伤的标志。这些炎性病理的共同之处是急性贫血。
最近，美国的一项研究表明，红细胞在病理状态中具有免疫哨兵的功能。作者将对该研究的概述以“DNAbindingtoTLR9expressedbyredbloodcellspromotesinnateimmuneactivationandanemia”为标题，发表在《ScienceTranslationalMedicine》。
败血症时，红细胞表面的TLR9增加，红细胞与病原体DNA结合
虽然核酸敏感型Toll样受体9（TLR9）是一种核内体核酸感应受体，但最近的研究发现，TLR9存在于肠道上皮细胞、脾脏树突状细胞、活化血小板和少量外周血单核细胞的表面。另外，作者使用了抗体检测和共聚焦显微镜证明了TLR9在哺乳动物红细胞中表达是保守的，其DNA结合外域位于红细胞表面（图1A）。
免疫刺激的非甲基化CpG基序是微生物DNA的一个特征，通过将RBC与来自疟原虫肺细胞培养基的*团菌肺细胞培养基一起孵育，测试RBCs（健康人供体）结合细菌DNA或疟疾mtDNA的能力。与细菌DNA或恶性疟原虫DNA孵育后，分离红细胞，PCR扩增16SRNA基因(细菌DNA)或coxIII(疟疾mtDNA)。发现，与细菌或疟疾DNA孵育后，红细胞上可扩增的微生物DNA呈剂量依赖性增加(图1C和D)。根据恶性疟原虫基因组中发现的RBC序列，检测合成的CpG与RBC的结合，证实了人类RBC与疟疾DNA结合的能力。这表明，人类红细胞可以结合病原体DNA。
TLR9的配体（含有CpG的线粒体DNA）在败血症时循环中升高。因此，作者检测了败血症危重患者红细胞上TLR9的表达。使用TLR9的流式细胞术，作者发现败血症患者的红细胞表面TLR9比健康献血者的红细胞表面TLR9增加(图1F)。接下来，作者进行定量PCR(qPCR)测定来自健康志愿者和重症败血症患者的红细mtDNA含量，进一步证实，在人败血症期间，红细胞上的mtDNA升高(图1G)。因此，在人类败血症过程中，红细胞表达的TLR9及其配体mtDNA均会被激活。接下来，作者检测了败血症小鼠模型、细菌性肺炎和全身寄生虫感染(嗜肺*团菌和弓形虫)小鼠模型的血浆和红细胞上的线粒体DNA(coxI)。在所有感染动物模型中，与血浆相比，红细胞上的mtDNA均升高(图1H和I)。这些数据表明，在肺炎、寄生虫感染和多菌感染期间，含有CpG的线粒体DNA被隔离在红细胞上。
DNA结合导致红细胞结构和功能改变
电子显微镜观察到大剂量CpG处理(nM)后红细胞形态的广泛变化（图2A和B)。红细胞形状的变化与CpG结合后细胞骨架蛋白、光谱蛋白和肌动蛋白的分布明显有关(图2C)。接下来，作者检测了CpGDNA处理后红细胞膜蛋白——带3蛋白的分布。分别使用GpCDNA和GpGDNA处理红细胞。结果显示CpGDNA结合以TLR9依赖的方式改变红细胞形态（图2F）,改变的细胞均为TLR9阳性（图2G）。在低浓度的细胞外CpGDNA存在下，红细胞在形态学上保持不变。然而，当CpG不断增加导致红细胞畸形(图2H和I)。CpG的加入降低了红细胞渗透脆性(图2J和K)。总之，TLR9胞外区的表面可及性可以通过CpG暴露来调节，并且CpG与红细胞的结合改变了红细胞的结构和功能。
CpG与红细胞结合导致CD47检测丢失
红细胞存活由多种因素决定，包括膜完整性、磷脂酰丝氨酸(PS)外化和CD47表达。作者检测了CpG处理红细胞后PS外化和CD47表达。通过与检测CD47的抗吞噬表位的抗体的结合来测量，观察到CD47的丢失(图3A和B)。在加入CpGDNA后，CC2C6阴性的细胞比CC2C6阳性的细胞相结合了更多的DNA，提示红细胞获得CpG导致CD47丢失。流式细胞术成像显示大多数CD47Dim细胞发生了改变。在单克隆TLR9抗体存在下，CpG对CD47的掩蔽作用减弱。另外，初始（nave）人红细胞与恶性疟原虫培养上清的孵育也导致抗吞噬表位的大量丢失(图3C和D)。
用nMCpG孵育红细胞，通过成像流式细胞术，观察到CpGDNA导致红细胞结构和CD47和TLR9重新分布的改变(图3E)。将红细胞与CpG孵育2小时后，使用2D3（抗-CD47抗体）抗体检测的CD47表位增加(图3F和G)。因此，CD47的构象变化与CpG结合后的定位改变有关。
携带DNA的红细胞会加速红细胞吞噬并启动先天免疫反应
由于CD47是自身的标志，CD47的丢失导致红髓F4/80阳性脾巨噬细胞(RPM)的红细胞吞噬加速，作者询问了红细胞与CpG结合是否会导致红细胞通过RPM加速清除。表达绿色荧光蛋白(GFP)的红细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或CpGDNA处理2小时后清洗并注入小鼠体内。输注1小时后脾脏分析显示F4/80hi巨噬细胞摄入GFP红细胞。与PBS处理的红细胞相比，CpG处理的红细胞显示出更高的红细胞吞噬巨噬细胞百分比(图4A-C)。这些发现表明红细胞暴露于高浓度的CpGDNA导致体内红细胞吞噬加速。
作者探索了患有贫血和败血症危重患者与没有贫血的败血症危重患者之间mtDNA差异。观察到，危重败血症贫血患者红细胞相关mtDNA高于非贫血败血症患者，结果支持携带DNA的红细胞会加速的吞噬红细胞作用(表1)。
为了分离红细胞在引发全身炎症中的作用，我们使用了带CpG红细胞输注的还原模型。CpG-RBC输注后6小时的脾脏组织学检查也显示中性粒细胞浸润增加，红髓充血增强(图4E和F)。对红细胞或CpG处理的小鼠脾脏进行RNA测序(RNA-seq)。与PBS处理的红细胞相比，CpG-红细胞引发了一个以干扰素(IFN)信号通路基因表达增加为特征的转录组反应(图4G和H)。总之，携带CpG的红细胞会加速红细胞吞噬并启动局部和全局性免疫反应。
CpG-RBC的红细胞吞噬和CpG诱导的炎症依赖于RBC-TLR9
抗体mIAP阻断小鼠红细胞上的抗吞噬CD47表位。作者用CpG处理野生型(WT)的红细胞，结果导致TLR9依赖性的CD47缺失(图5A-B)。TLR9KO小鼠在循环中也表现出更多的CD47阴性的红细胞。
为了确定加速的红细胞吞噬作用是否依赖于RBC表达的TLR9，作者检测了未处理的WT和TLR9KO小鼠红细胞的吞噬功能。用PaulKarlHoran(PKH)染料标记WT和TLR9KO红细胞，混合后输注给未成熟的WT小鼠。观察到，脾脏吞噬细胞摄取WT红细胞多于TLR9KO红细胞(图5C和D)。这与作者之前观察到的WT红细胞比TLR9KO红细胞内源性mtDNA含量高一致。用PKH染料标记TLR9KO和WT红细胞，将CpG处理的红细胞接种于WT或TLR9KO小鼠。作者观察到，F4/80hi巨噬细胞比KO红细胞摄取更多的WT(图5D)。这种效应似乎是由红细胞驱动的，因为TLR9KO小鼠的巨噬细胞摄取了与WT巨噬细胞类似数量的红细胞。为了了解红细胞TLR9在体内固有免疫反应中的作用，作者培养了红细胞TLR9KO小鼠(图6A-B和表3)。红细胞TLR9/小鼠(Erytlr9/)的红细胞细胞不表达TLR9。作者将WT和Erytlr9/小鼠置于CpG诱导的炎症还原模型中。CpG给药导致WT和Erytlr9/小鼠循环白细胞减少和脾脏重量增加。Erytlr9/小鼠脾脏、肝脏和血浆中IL-6的产生减少(图6C-E)，同时，表现出肝内皮细胞活化和TLR9上调的减弱，但没有IL-10、干扰素-或IL12p70产生。这些发现表明，RBC-TLR9介导的CpG传递调节局部和全身IL-6的产生。
为了确定红细胞-核酸结合是否有助于败血症期间的先天免疫反应，作者将WT和Erytlr9/小鼠置于盲肠浆液败血症模型。盲肠浆液注射可引起WT小鼠红细胞线粒体DNA截留增加，但对Erytlr9/小鼠无明显影响(图6F-G)。作者检查了脾脏的炎症反应。在盲肠浆液诱导的败血症过程中，没有RBCTLR9的情况下，脾脏IL-6和肿瘤坏死因子-的产生被减弱(图6H-I)。此外，血浆IL-6在WT中与RBC-结合mtDNA相关，但在Erytlr9/小鼠中不相关(图6J)。这些发现表明，红细胞在败血症期间获得CpG-DNA，而红细胞-TLR9依赖的DNA传递驱动了败血症期间的局部固有免疫反应。
最后，作者发现，与健康对照组相比，COVID-19患者中红细胞结合的mtDNA水平升高(图7A)，并随疾病严重程度增加(图7B)。新冠肺炎患者红细胞结合线粒体DNA与血红蛋白浓度有关，并且这种关联是由严重疾病驱动的(图7C至E)。当用中位血红蛋白分层时，COVID-19贫血患者的红细胞相关mtDNA高于非贫血患者(图7F-H)。将ApacheIII评分系统用于定义疾病严重程度，作者观察到红细胞结合的mtDNA与疾病严重程度之间的相关性(图7I和J)。与作者在小鼠模型中加速红细胞吞噬和炎症的发现一致，COVID-19患者中红细胞结合的mtDNA与贫血和疾病严重程度相关。
总结
作者的数据表明，红细胞通过TLR9的表面表达充当DNA传感器，这在静止状态下似乎是有益的，在静止状态下，它促进清除微量CpG，以防止非特异性炎症。然而，在CpG过剩的情况下，如败血症和COVID-19，RBC-TLR9与CpG结合导致清除和炎症加速。这种先天免疫机制可能有助于清除受损的红细胞，并可能在细胞游离DNA升高的病理状态下导致全身炎症和贫血。因此，RBC上TLR9的DNA识别为RBC作为免疫哨兵提供了可靠的证据。
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