巴贝斯虫核酸检测试剂盒荧光PCR法 [复制链接]

巴贝斯虫（Bab）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

作I者I搜I索：疾控科研试剂博客

联I系：I99I--I94

通用名称：巴贝斯虫（Bab）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

Name：BabesiaDetectionKit(Real-TimePCRMethod)

25T/盒、50T/盒

巴贝斯虫病是一种蜱传性的血液原虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起，其临床特征为发热、

精神沉郁、嗜睡、*疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等，对健康造成了巨大的危害。[1-2]本

试剂盒适用于检测血液中的巴贝斯虫，用于巴贝斯虫感染的辅助诊断,仅科研。

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对巴贝斯虫基因组特异性引物，结合一条特异

性探针，用荧光PCR技术对巴贝斯虫基因组的DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学

诊断。

包装规格25T/盒50T/盒

Bab反应液μL×1管μL×2管

酶液25μL×1管50μL×1管

Bab阳性质控品50μL×1管50μL×1管

阴性质控品μL×1管μL×1管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

ABI、安捷伦MXP/P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

无菌注射器抽取血液3~5mL至EDTA-2Na抗凝管

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，

严禁反复冻融。

1.1.1

组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入

1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，rpm离心2min，取上清液μL于1.5mL

灭菌离心管中；咽拭子样品直接取μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2

推荐采用上海研生实业有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提

取，请按照试剂说明书进行操作。

2.根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满

10份，多配制1份)，每测试反应体系配置如下表：

试剂Bab反应液酶液

用量（样本数为N）20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.将步骤1提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，

短暂离心。

4.PCR

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；上海研生实业有限公司

荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI系列仪器请勿选择

ROX参比荧光，选择None即可。

4.3推荐循环参数设置：

5.步骤循环数温度时间收集荧光信号

11cycle95℃10min否

cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.1

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像

调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的

Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2

阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道35Ct值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35Ct值≤38，且曲线有明显的增长曲线，

判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果Ct值38或无Ct值。

6.阴性质控品：Ct38或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配置、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。