本文转自：中国医药报
□焦童
G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）广泛存在于各种生物体内，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一个关键酶和限速酶，其主要功能是产生还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。NADPH对于维持细胞的正常生理功能和形态极为重要。当机体缺乏NADPH时，红细胞极易受到氧化损伤，从而引起溶血性疾病。蚕豆病是G6PD缺乏症的一个类型，患者在进食蚕豆或蚕豆制品后会引发急性血管内溶血性贫血，临床表现为皮肤、巩膜*染，有些病例还会出现血红蛋白尿，有些则有肝肿大现象。
G6PD基因突变是导致G6PD缺乏症的主要原因，G6PD基因定位于X染色体（Xq28），由13个外显子和12个内含子组成，编码个氨基酸。G6PD缺乏症属于X连锁不完全显性遗传，对其进行早期诊断和预防十分重要，因此G6PD检测试剂临床价值较高。由于G6PD检测试剂临床使用风险也较高，国际对相关产品的性能评估要求十分严格。同时，国内相关企业研发生产流程仍须进一步规范。
常用检测方法
目前，G6PD常用检测方法包括酶学检测法和基因检测法两大类。其中，酶学检测法的原理是检测G6PD含量及活性。G6PD酶活性检测方法具有操作便捷、价格低廉等诸多优点，目前广泛应用于临床诊断领域。该类方法主要包括葡萄糖-6-磷酸底物法、G6PD/6PGD(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)比值法、高铁血红蛋白还原法、荧光斑点法等。
常规基因检测法的原理是检测G6PD基因的突变情况。该类方法主要包括等位基因特异性扩增法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、错配聚合酶链反应/限制性核酸内切酶图谱分析技术等。
已批准相关产品概况
目前，已获批上市的G6PD检测试剂采用的检测样本涵盖血清、全血、新生儿足跟血滤纸干血片等多种类型。
其中，采用基因检测法的G6PD检测试剂主要用于体外定性检测人外周血基因组DNA中的中国人群常见的G6PD基因突变。其方法学主要包括荧光定量PCR熔解曲线法、PCR-反向点杂交法等。
酶学检测试剂采用的方法学多为葡萄糖-6-磷酸底物法。G6PD能够在氧化型辅酶Ⅱ（NADP）的存在下，催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH。通过在nm处测定吸光度，可计算出NADPH的生成速率，从而检测G6PD的活性。
此外，还有比值法检测试剂。在该产品中，试剂A液和B液能够分别在不同通道采用速率法检测红细胞中G6PD与6PGD的活性，反应原理均为催化其相应的底物反应，同时将NADP还原为NADPH。通过检测nm处吸光度上升速率来计算G6PD与6PGD的活性，再通过计算二者的比值，进而判断出人体是否缺乏G6PD。
国际产品性能评估要求
世界卫生组织（WHO）于年10月发布的《葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测体外诊断试剂指导原则》，根据性别和G6PD活性将人群划分为G6PD正常、缺陷和中介样本。该指导原则对G6PD活性检测试剂分析性能评估的要求概述如下。
适用样本类型
为证明样本类型以及产品抗凝剂的等效性，均应至少各选用25个G6PD正常样本、中介样本和缺陷样本。
样本收集、储存和运输
在样本稳定性研究中，研究者应考虑到储存条件（包括不同温度下的持续时间、湿度变化、温度限制、冻融循环等），运输条件（如适用），样本采集和转移装置（包括干血斑滤纸）是否含有抗凝剂、是否可以密封等诸多因素。
精密度
在重复性和再现性试验中，研究者应根据预期用途各选用至少1个G6PD正常样本、中介样本和缺陷样本；应确保所选样本在关键决策点附近、具有良好的G6PD活性；必须证明在关键决策点附近的样本具有良好的精密度。此外，每个测试样本均应采用3批试剂，进行5个重复，运行3~5次，并应选择3个不同的试验地点。
分析灵敏度
最低检出限研究者应选择至少8个样本开展最低检出限研究，每个浓度至少检测15次；应将95%检出率的最低酶活性作为最低检出限。此外，对于被检测样本的酶活性，应采用合适的生物学参考物质以及参考方法进行校正。
关键决策点性能验证研究者必须验证产品区分G6PD活性（如正常、缺陷、中介）的能力。可通过采用含不同比例G6PD正常和缺陷的混合样本，检测其广泛的G6PD活性，从而了解决策点（即缺陷/中介/正常）的性能。需要注意的是，应至少测试含3对单独试样的混合物。
测量范围和相关性对于定量检测试剂，研究者必须采用经合适的生物学参考物质以及参考方法进行校正的、G6PD活性已知的样本开展测量范围研究。对于已知G6PD活性样本的平行试验结果，应进行适当的统计学分析，还应确定定量与参考方法的相关程度。
对于评估报告结果包含血红蛋白浓度或将血红蛋白浓度进行标准化处理的检测试剂，还应确定测定血红蛋白浓度的定量测量范围和相关程度。
分析特异性
在特异性研究中，研究者必须研究假正常或假缺陷结果的可能性，该研究可采用自然或人工样本开展。在干扰因素方面，内源性干扰因素包括血脂、胆红素和蛋白质升高样本，白细胞和血小板升高样本，白血病或其他红细胞疾病等；外源性干扰因素包括抗寄生虫、抗疟疾、抗逆转录病*和抗结核药物，普通非处方抗炎药物（如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬等），以及乙醇、咖啡因和某些类固醇激素（如醛固酮）等。
我国目前已有G6PD检测试剂获批上市，还有部分产品正处于研发或计划申报阶段。该类产品用于检测人体样本中的G6PD，在临床上主要用于遗传性红细胞G6PD缺乏症辅助诊断，临床价值较高，同时临床风险也较高。
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