近日，美国休斯顿大学卡伦工程学院JohnRebeccaMoores冠名教授PeterVekilov博士成为自年以来第十七名美国晶体生长协会（AACG）奖得主，此奖一般两到四年颁发一次。他也是德国ALV品牌激光光散射仪资深用户。
今天我们就来介绍一项他的工作。他和合作者利用激光光散射技术探讨了游离血红素在模拟生理溶液中镰状细胞血红蛋白（HbS）分子间相互作用中的所起到的作用：脱氧HbS聚合是镰状细胞贫血的主要致病事件，HbS在自氧化后比正常成人血红蛋白更容易释放血红素。他们通过静态光散射确定渗透维里系数来描述这些相互作用。结果表明，在缺乏血红素的情况下，HbS分子的吸引力较弱，而这种吸引力并不因为镰状细胞突变分子电荷导致的分子密度降低引起。他们发现，暴露在脱氧态的两个ab二聚体之间的界面部分在这种吸引中扮演着更为关键的角色。这项工作阐明了微摩尔浓度的血红素诱导了血红蛋白分子之间的强大吸引力，并发现血红素的高效性来自血红素和血红蛋白分子之间静电和疏水相互作用的统计。相关工作以Freehemeinmicromolaramountsenhancestheattractionbetweensicklecellhemoglobinmolecules为题，发表在Biopolymers91()-上。
研究背景：镰状细胞贫血是一种异常血红蛋白病，常引起溶血性贫血。当前治疗方案是使用羟基脲和对症药物、输血和骨髓移植。但这些方法并非尽善尽美，例如羟基脲只对不到一半的患者有益，所以寻找其回春妙术的工作仍在继续。该病发病机制涉及了很多细胞和分子层面的因素，但镰状细胞患者红细胞中表达的突变血红蛋白（称为镰状细胞血红蛋白，HbS）的聚集被认为是主因。聚合导致红细胞被拉伸和硬化，改变了细胞膜的正常组成。有研究表明，延迟聚合可以防止镰状危机。所以，减缓聚合速率为镰状细胞贫血治疗打开了一扇具有光明前景的大门。
蛋白质聚集动力学受溶液组成的影响，因此可以在红细胞胞浆中存在的大量有机或无机小分子中寻找可能调节聚合的组分。血红素如下图①a所示，就是这类分子，由于HbS自氧化为metHbS，在镰状红细胞中过度释放，如下图b所示；HbS的稳定性低于正常成人血红蛋白（HbA）。于是本工作研究了血红素对溶液中血红蛋白分子间相互作用的影响。HbS与正常成人血红蛋白HbA的不同之处在于，从谷氨酸到缬氨酸的单一氨基酸替换使HbS比HbA更为阳性。为了突出电荷效应，本工作比较了HbS溶液和HbA溶液中的相互作用。此外，由于HbS仅在静脉循环中聚合（在动脉红细胞中检测到未溶解的聚合物），其中大部分是脱氧的，因此研究了脱氧HbS溶液中的相互作用，并将其与羧基单氧血红蛋白（一种氧合血红蛋白的结构类似物）溶液中的相互作用进行了比较。
图①
本工作采用了静态光散射方法，此前曾有人将其用于检测血红蛋白溶液中的相互作用。光散射在研究血红蛋白/血红素体系时面临两个挑战：（1）血红蛋白和血红素会吸光，在弹性散射表征相互作用时，需要在数据解析中考虑吸收因素。（2）由于血红素和血红蛋白都是带电的，因此它们之间的长程库仑相互作用可能会扮演非常重要的角色，散射光就不仅仅只会受成对分子间相互作用的影响。三联体之间的相互作用，特别是各向异性的血红蛋白-血红素-血红蛋白类型的三联体，可能会明显影响散射光强。因此，应使用三组分体系（溶剂和两种溶质）中的光散射理论来定量解释结果。相关方法在科学文献中都得到了广泛应用。包括血红蛋白溶液在内的溶液吸收的光散射很常见，已有人对该问题进行了实验和理论研究。三组分体系的光散射理论是在年发展起来的，已经“身经百战”，至今“宝刀不老”。
光散射法可以通过第二渗透维里系数A2及其无量纲当量B2来表征双组分体系（溶剂+溶质）中的相互作用。在溶剂+两种溶质的三组分体系中，这两个系数由有效值A2,eff和B2,eff代替。在血红蛋白浓度低于20mg/ml情况下确定这些系数，并对血红蛋白分子对之间的相互作用进行半定量表征，包括血红素介导的相互作用。从这里可以得出关于血红素作用机制的结论。这些机制不仅在低血红蛋白浓度下起作用，也会在高血红蛋白浓度下起作用，例如在mg/ml的红细胞胞浆中，当然在红细胞胞浆中会受到多种身体效应影响。
实验细节：
样品纯化及前处理细节略。本工作在ALV-/EPP动静态激光光散射仪上进行，采用波长为.8nm功率为35毫瓦的氦氖激光器作为光源。血红蛋白浓度在5至20mg/ml范围内。使用直径为10mm的样品瓶，散射角为90°，测试温度为23℃。由于血红蛋白分子直径（约5.5nm）明显小于波长，所以样品没有角度依赖性，符合瑞利散射机理。
结果讨论：没有血红素时血红蛋白分子间的相互作用
首先用第二渗透维里系数A2及其无量纲形式B2来表征溶液中血红蛋白分子之间的相互作用。这些系数由下图a-c的Debye作图确定。
图②
下表为计算结果。
对于脱氧状态下的HbS，A2的值与文献值详细。通过上图a和b可以发现，在没有血红素的情况下，脱氧态的B2与血红蛋白变体无关，在测定的误差范围内。在双组分体系中，无量纲B2＜4表示分子对之间的吸引力。而B2=4表明无相互作用的硬球的特征，其中有效斥力是由于分子占据的体积产生的。
HbA和HbS因β链第六位的氨基酸不同而异（血红蛋白是一种四聚体，由两条a链和两条b链组成，其成分通常标记为α2β2，见图①b）。HbA在β6位置含有谷氨酸，而在HbS中，它被非极性缬氨酸取代。在实验pH值下脱去质子的谷氨酸残基增加了血红蛋白分子的电荷，可能有助于排斥作用，而非极性缬氨酸则增强了疏水吸引力。两种变体β2的相似性表明血红蛋白分子之间的相互作用不受谷氨酸与缬氨酸取代的影响。这可能源于两种因素：
Ⅰ测试在0.15M磷缓冲液中进行，离子强度大约为0.3M。在这种离子强度下，德拜长度也就是静电相互作用的特征距离大约为5?。该长度与血红蛋白分子表面的粗糙度相当，表明主要静电斥力是屏蔽的。
ⅡB2是分子间相互作用的整体特征，其中分子间势能在所有空间角度和间隔上取平均值。因此，这两个分子β6位置的氨基酸残基的贡献被其余分子的贡献掩盖了。
需要指出的是，如果分子距离小于5?，静电和疏水作用将显而易见，这就解释了为什么含有疏水性缬氨酸的HbS会形成聚合物，而HbA溶液即使在高达mg/ml的浓度下也是稳定的。
从图②及表中可以看出，CO-HbA的B2为正值，明显大于脱氧HbA的B2，表明处于CO状态的HbS分子之间存在强烈的排斥作用。这些条件下A2的值与参考文献中0.05M磷酸盐缓冲液中测定的值相似。为了理解CO-和脱氧血红蛋白分子之间不同类型的相互作用，本工作注意到血红蛋白存在于两种不同的构象状态中，即绷紧（T）状态和松弛（R）状态。脱氧血红蛋白处于T状态，CO-和O2-血红蛋白处于R状态。T到R的转变涉及一个αβ二聚体相对于另一个二聚体的旋转和移位，这导致破坏和/或形成新的氢键和跨越二聚体-二聚体界面的盐桥。T态氢键/盐相互作用更多。R态有更多不饱和电荷残基（盐桥位置）和不饱和氢键，这两者可能导致CO-分子间排斥作用增强。
微量游离血红素可增强吸引力
为了探索血红素对分子间相互作用的影响，首先通过透析去除血红蛋白分子释放的任何游离血红素。将摩尔浓度为m1=50μM（c1=0.mg/ml）的血红素添加到脱氧HbA和HbS溶液（其浓度c2范围对应于80μM＜m2＜μM）中。在此处所用的pH值为7.35时血红素会形成二聚体或者聚集度更高一些的低聚物。然而，由于无法确定血红素单体和低聚物的浓度，因此本研究使用血红素总浓度作为血红素效应的参数。图②e和d显示了血红素存在时脱氧HbS和脱氧HbA的德拜图。对于HbS和HbA，M2,app、A2,eff和B2,eff随血红素添加而降低。虽然两组分体系中B2值的变化可直接归因于吸引力或排斥力的增强，但三组分体系中的相关性并不明显。为了了解血红素是否诱导更强的吸引或排斥，本研究评估了二组分和三组分混合物中蛋白质的化学势μ2(c2)。
Kc2/Rθ的比值与血红蛋白的渗透压关?π/?c2：
其中π是溶液的渗透压。反过来，渗透压缩性通过Gibbs-Duhem关系与化学势有关：
经过一系列推导得出在不含血红素的情况下血红蛋白化学势的表达式：
或者在血红素存在的情况下：
下图为结果：
图③μ2(c2)依赖性表明：在所测浓度下，添加血红素可降低HbS和HbA的化学势μ2。因为μ2是一种力，表明血红蛋白逃离系统的一般趋势。μ2变小表明血红蛋白分子之间吸引力增加。血红素促进血红蛋白分子之间的引力，无论HbS还是HbA，前者增强幅度更大。
（具体解析内容略）
结论：
本工作发现脱氧镰状细胞血红蛋白分子在近似生理溶液中的弱吸引。并表明，正常成人血红蛋白的脱氧分子之间的平均吸引力与镰状细胞血红蛋白相当。这表明，这种吸引力不是由于镰状细胞从谷氨酸突变为缬氨酸导致HbS分子的负电荷降低所致。当血红蛋白在氧合状态下处于绷紧构象时，分子相互排斥。这一发现突出了血红蛋白四聚体中两个αβ二聚体之间的界面在分子间相互作用中的作用。
本工作表明，添加微量的血红素会引起血红蛋白分子之间的强烈吸引力。分析表明，静电、疏水行为以及分子统计的独特组合导致了这种吸引力：负血红素分子静电排斥负血红蛋白分子。血红素的排斥作用排斥了血红蛋白分子的部分体积，并诱导它们之间的有效吸引。对于正常人血红蛋白来说，血红素与血红蛋白的疏水性结合似乎更强，但镰状细胞之间的有效吸引力比正常血红蛋白分子之间的更大。血红素的高效性是静电斥力的长程性质的结果，因此单个血红素分子与许多血红蛋白分子相互作用。
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