#mrna体外合成#
在中心法则中，遗传信息从DNA流向mRNA（转录过程），再从mRNA流向执行生理功能的蛋白（翻译过程）。遵循此思路，mRNA技术就是在体外利用生物技术手段合成mRNA再将其导入细胞内，利用细胞内翻译系统合成出功能蛋白，使得人体细胞自身成为生产目标蛋白的工厂，从而应用于疫苗、蛋白替代疗法、肿瘤免疫治疗、基因编辑等众多生物医药领域。
在mRNA合成反应中，最关键的是合成出的mRNA具有和细胞内源性mRNA相同的特征，通过添加修饰核苷酸、帽子和尾巴结构以逃脱细胞内天然免疫系统的识别，提升体外合成的mRNA稳定性和翻译效率。
关于体外合成mRNA，上一期星耀小课堂有相关粗略介绍（详见mRNA合成
InVitroTranscription并非想象的那么简单，这次将详细介绍体外合成mRNA及常用方法。
一、T7RNA聚合酶体外转录反应
?T7RNA聚合酶
在细菌中，一种RNA聚合酶几乎负责所有mRNA、rRNA、tRNA的合成。大肠杆菌RNA聚合酶是原核生物RNA聚合酶中研究最清楚的酶，它首先由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个亚基组成核心酶，然后加上一个亚基则成为聚合酶全酶。真核生物中共有3类结构相对更复杂的RNA聚合酶。RNA聚合酶Ⅰ转录产物是45SrRNA前体，经剪接修饰后生成除了5SrRNA外的各种rRNA；RNA聚合酶Ⅱ转录生成mRNA的前体分子，即核内不均一RNA（hnRNA,heterogeneousnuclearRNA），经剪接加工后生成的mRNA被运送到胞质中作为蛋白质合成的模板；RNA聚合酶Ⅲ催化的主要转录产物是mRNA、5SrRNA、snRNA（核内小RNA），其中snRNA参与RNA的剪接。3类真核生物RNA聚合酶一般都由8-16个亚基所组成，相对分子质量超过5×其中，RNA聚合酶Ⅱ的两个大亚基，RPB1和RPB2，与细菌核心酶的两个大亚基（β和β’）是同源的；其RPB3和RPB11与α亚基、RPB6与w亚基是同源的。非常有意思的是，自然界中存在单亚基的RNA聚合酶，同样可以完成复杂的转录过程。如T7噬菌体聚合酶（T7RNAPolymerase），多数线粒体和叶绿体的基因也是由一些与此类单亚基噬菌体酶密切相关的聚合酶转录的。T7RNA聚合酶是研究得最为广泛的单亚基RNA聚合酶，分子质量为KD，而细菌的核心酶为KD（不包括σ因子）。T7RNA聚合酶在结构上与DNA聚合酶相似，但也仍具有RNA聚合酶的一些特征，例如，同细菌RNA聚合酶一样，T7RNA聚合酶具有各种各样的通道进出活性中性裂隙。T7RNA聚合酶对启动子具有非常高的特异性，结合到启动子上以后，便重复循环启动和释放流产转录产物。当转录产物RNA长度达到8-12nt时，T7RNA聚合酶经历构象转变，进入到高进程性的延伸阶段。当其遇到终止序列或者到达线性模板末端时，整个转录过程终止。噬菌体T7RNA聚合酶是一种依赖于DNA模板的RNA聚合酶，被广泛应用于体外转录系统合成RNA，具有许多独特的优势：与细菌或真核RNA聚合酶相比，T7RNA聚合酶为单亚基聚合酶；对T7启动子序列保持强烈的特异性识别作用；与细胞内转录启动事件相比，不需要特殊的转录因子来协助启动；可以转录出长片段的RNA序列；不需要特殊的转录终止信号。T7RNA聚合酶体外转录反应
一般市场销售的商业化的20ulT7RNA聚合酶合成体系产量可以达到80ug-ug。通过T7RNA聚合酶系统可以实现从毫克到克级别的mRNA合成，合成几十个核苷酸长度到个核苷酸长度的RNA。典型的T7RNA聚合酶体外转录系统由以下几个方面组成:
模板序列：线性化的质粒或者PCR扩增后的片段。模板序列必须包含T7启动子序列、5UTR序列、ORF序列、3’UTR序列、PolyA尾巴序列。ORF序列优化可以通过密码子优化软件来完成。目前，PolyA尾巴序列常常包含在质粒模板上，因为酶法合成PolyA尾巴会产生长度不均一尾巴序列。此外，质粒模板必须含有一个特异性的酶切位点完成质粒线性化，否则T7RNA聚合酶将以环状质粒DNA为模板循环转录出远超预期长度数倍的RNA产物。
4种游离核苷酸原料：ATP、CTP、GTP、UTP。
T7RNA聚合酶。
RNase抑制剂：用来抑制可能存在的污染RNase活性。
焦磷酸酶：用于水解RNA转录过程中生成的大量焦磷酸，解除焦磷酸对于转录反应的抑制以提升转录反应效率和产量。
镁离子：镁离子是T7RNA聚合酶的辅因子。
PH缓冲Buffer：含有最佳浓度的抗氧化剂和多聚胺。
二、mRNA加帽反应
5‘鸟嘌呤-N7-甲基帽子结构是真核生物mRNA非常显著的特征。帽子结构同mRNA剪接，mRNA出核，翻译起始等密切相关。mRNA帽子结构还可以保护其免遭5’-3‘外切核酸酶降解，稳定mRNA结构。若没有帽子结构将导致mRNA不可逆降解。
mRNA加帽反应涉及在5’末端添加一个修饰过的鸟嘌呤碱基。这个反应是由鸟苷酸转移酶完成的，反应非常迅速，很难在体外或体内测得5’自由三磷酸基团的存在。据测算，在新生mRNA链达到50个核苷酸之前，甚至可能在RN聚合酶Ⅱ离开转录起始位点之前，帽子结构就已经加到mRNA的第一个核苷酸上了。一般认为，帽子结构是GTP和原mRNA5’三磷酸腺苷缩合反应的产物，新加上的G与mRNA链上所有其他核苷酸方向正好相反，像一顶帽子倒扣在mRNA链上，故而得名。
具体来讲，这是一个甲基化的鸟嘌呤，而且是以一种不常见的包括3个磷酸盐的5‘-5’连接方式插入到RNA转录物中,由此形成的最基本的帽子结构，称为零类帽子(Cap0)。
真核生物mRNACap0的形成，需要3个连续的酶促反应，涉及RNA三磷酸酯酶（triphosphatase），鸟苷酸转移酶(guanylytranferase)，甲基转移酶(guanine-N7-methyltransferase)。
第一步：mRNA原始转录本5‘端的γ-磷酸盐由RNA三磷酸酯酶去除（转录形成的原始转录本5’末端保留着α-，β-，γ-磷酸盐），形成5‘末端含有2个磷酸基团的mRNA。
第二步：鸟苷酸转移酶把来自GTP供体的GMP添加到mRNA5末端的β磷酸盐上，形成5’-5‘三磷酸连接的未甲基化的帽子结构。
第三步：甲基转移酶利用SAM作为甲基供体将mRNA5末端未甲基化的鸟嘌呤碱基N7位置甲基化。
尽管这些酶促反应的顺序在真核生物中非常保守，但是执行这些功能的酶在不同的物种中存在差异。在酵母细胞中，加帽反应中3个酶活性存在于不同的蛋白中，而在更高等的真核细胞中，这些不同的酶活性存在于一个蛋白亚基中。
在酵母中，最常见的RNA帽子结构是Cap0，而在更高等的真核细胞中，在紧接帽子结构后面的核苷酸可以发生额外的甲基化，最常见的修饰是紧接帽子结构的第一个核糖2‘-O位置发生甲基化，形成Cap1；第二个核糖的2‘-O位置发生甲基化，形成Cap2。不同真核生物中，Cap0，Cap1，Cap2在mRNA之间的比例是不相同的。
在细胞质中复制的病毒要么自己携带可以编码病毒RNA加帽机器的基因，要么携带可以编码从真核生物mRNA转移帽子结构的帽子夺取机器的基因。尽管甲基化程度有差异，但是可以看到很多病毒RNA具有帽子结构。例如，烟草花叶病毒mRNA具备Cap0结构、牛痘病毒mRNA具备Cap1结构。在体外转录系统中，目前常用的加帽方式有2种，一种是酶法加帽，另外一种是共转录加帽。酶法加帽是先体外合成mRNA，纯化后借助加帽酶系统来完成加帽反应。共转录加帽指的是转录反应进行时，帽子结构类似物核苷酸就被添加到mRNA5末端，一步反应即可。1.酶法加帽（Enzymaticcapping）
使用加帽酶进行转录后加帽，最常使用的是牛痘病毒加帽酶（VacciniaCappingEnzyme，VCE）。牛痘加帽酶是由D1（个氨基酸，97kDa）和D2（个氨基酸，31kDa）组成的异源二聚体。D1蛋白N端结构域具有RNA三磷酸酯酶（Triphosphatase）和鸟苷酸转移酶（Guanylatetransferase），而C端结构域具有甲基转移酶（Methyltransferase）。D2蛋白不具有催化活性，但可以刺激D1蛋白甲基转移酶的活性。
牛痘病毒还可以编码2′-O-甲基转移酶（2′-O-methyltransferase），该酶利用S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)为甲基供体，在RNA5端紧邻帽结构(Cap0)的第一个核苷酸的2-O位点添加甲基，形成带有Cap1结构的mRNA。Cap1结构能够增强mRNA的翻译效率，并且降低mRNA结构本身的免疫原性，提升mRNA蛋白翻译表达水平。2′-O-methyltransferase酶特异性识别7-甲基鸟苷帽结构(m7Gppp，Cap0)，不作用于5端为pN，ppN，pppN或GpppN的RNA。
在加帽反应之前，IVT反应原液需要先纯化以去除残留蛋白和游离的核苷酸。mRNA5’端可能存在复杂的二级结构而阻止加帽酶靠近，因此在加帽反应之前需要对mRNA加热处理以打开二级结构。牛痘加帽酶系统和2′-O-甲基转移酶可以在同一个体系中进行反应。
2.共转录加帽（Cotranscribedcapping）
在体外转录反应中，通过使用帽子类似物（m7G-ppp-X）来共转录制备携带帽子结构的mRNA，只需要一步就可以完成，减少工艺生产步骤和所需要的酶种类，简便快速。
最开始使用的是帽子类似物m7Gp3G，T7RNA聚合酶起始转录的时候，m7Gp3G分子上的3‘OH会和mRNA转录出来的第二个核苷酸的α磷酸基因形成m7G(5)p3(5)GpN。但由于m7Guo分子（前文提过的m7G，甲基化的鸟嘌呤核苷酸）上面的3’OH同样可以发生亲核攻击，形成G(5‘)p3(5)m7GpN，将导致加帽mRNA产量降低50%。
为避免合成携带反向帽子结构的mRNA，研发人员把m7Guo分子上面的3’OH甲基化，合成反向帽子类似物ARCAs(anti-reversecapanalogs)（使用ARCAs合成的mRNA在体内的翻译效率要比使用传统的m7Gp3G合成的mRNA翻译效率高出2倍多）。
年，Ishikawa使用三核苷酸帽子类似物m7GpppA*pG（A为腺嘌呤核苷酸或甲基腺嘌呤核苷酸）实现IVT反应中RNA的加帽过程，突破以往IVT加帽反应的诸多限制。使用CleanCapAG合成携带Cap1结构的mRNA，产量可达5mg/ml。当CleanCapAG三核苷酸通过碱基互补配对结合到模板+1、+2位置的核苷酸上以后，与模板互补配对的游离NTP会插入到模板+3位置上核苷酸互补配对的位置。
之前在星耀小课堂中提过体外合成mRNA技术中5’UTR和3’UTR的优化设计，耀海生物耀海生物建立了天然UTR库，包含了常见高表达蛋白（如α-珠蛋白血红蛋白A1（HBA1））的UTR序列，可为针对不同品种匹配合适的UTR序列；可对天然5’UTR进行一定的改造，帮助模板更高效地转录；终止密码子、PolyA尾等结构采用国际前沿的设计策略。
而耀海生物在mRNA加帽技术层面的实力亦不容小觑。耀海生物mRNA合成与修饰平台采用稳定的加帽工艺（酶法或共转录法），可实现95%以上的加帽效率；还配置多种备选的修饰核苷酸，有效降低mRNA在人体中的不良免疫反应。目前耀海生物自主开发的科研级预制品mRNA-eGFP(增强绿色荧光蛋白)就是基于酶法加帽或共转录加帽生成的，下两图为采用常规脂质体转染试剂于细胞中转染加帽后的mRNA24h后实现的高水平荧光表达效果：
共转录加帽
酶法加帽
酶法加帽：该反应过程中加帽酶的异源二聚体会导致产量较低，短期内难以放大。特点：先转录后加帽，由于增加质控项目工序繁杂，尽管加帽效果好，但各类酶成本较高。
共转录加帽：加帽率大幅提升，成本逐渐降低，共转录加帽法越来越受各类学者青睐。特点：一步法加帽，转录时间较酶法更短，成本也更低。
耀海生物可根据客户需求制定合适的加帽方案，满足不同应用场景，实现高质量、高表达效率的mRNA产品服务。
星耀小TIP：单看反应过程耗时，共转录因一步法比酶法少2个反应过程（这两个过程可节省-min），再加上准备样品、添加反应试剂的操作时间，共转录比酶法节省至少3.5小时，不过这只是小量制备缩减的耗时，如果需求的mRNA量大，共转录法和酶法相应的时间差距也会相应放大。
三、共转录加帽一步法合成mRNA
mRNA合成体系
在IVT反应原料中，为降低合成mRNA的免疫原性，可以使用Pseudo-UTP/N1-Methyl-Pseudo-UTP1作为修饰核苷酸。反应温度为37℃，反应时间为3h，期间可适度混匀。
DNaseI处理消除模板DNA
DNaseI（DeoxyribonucleaseI，脱氧核糖核酸酶I）用于随机降解单链或者双链DNA，生成5-P末端寡核苷酸，其降解活性依赖Ca2＋，并被Mg2＋或Mn2＋激活。Mg2＋存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点；Mn2＋存在条件下，DNaseI能将双链DNA同时切断，使DNA片段化。根据IVT反应模板的量来调整加入DNAaseI的量，以完全消除线性化质粒DNA模板。待IVT反应结束后，加入DNaseI反应时间为30min。
四、总结
在体外合成mRNA反应中，必须让转录出来的mRNA携带上帽子结构以增加稳定性，和提升翻译效率。目前最常用的加帽方式是酶法加帽和共转录加帽。酶法加帽，相对来说成本较低，但是需要在合成初始转录本后进行纯化之后，再进行一次加帽反应，工艺步骤繁琐，增添QC检测项。共转录加帽，成本较高，但是只需要一步反应，变可直接进行纯化处理。随着未来三核苷酸帽子类似物合成成本的降低，共转录加帽在未来一定会占据绝对的优势。
mRNA合成处于mRNA技术平台中非常关键的位置。只有获得高产量，高纯度的mRNA，才能确保体外合成的mRNA经过下游制剂包封后，在体内发挥正常的生理功能。mRNA的产量和完整性（纯度）是IVT反应追求的两个最重要的指标，因此，需要对IVT反应配方原料之间的比例进行优化，提升mRNA产量，降低副产物的形成。从工艺生产的角度来看，mRNA体外合成的原料是由核酸行业上游供应商提供，对于mRNA技术新药研发公司来说，更加重要的是需要对众多的mRNA体外合成试剂盒进行比较测评分析，从中找到合成质量最好的产品。
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