近日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心JeremyDaleMurray课题组，在Science杂志在线发表了题为“NIN-likeproteintranscriptionfactorsregulateleghemoglobingenesinlegumenodules”的研究论文，首次报道了转录因子NLP家族对根瘤内豆血红蛋白基因表达调控机制。
中国科学院分子植物科学卓越创新中心助理研究员姜苏育为第一作者。欧易生物在本研究中承担表达谱芯片实验及分析工作。
研究背景
豆科植物可以与根瘤菌形成内共生，形成高度特化的根瘤，根瘤菌的固氮酶将氮转变为植物可以利用的氨。固氮反应需要消耗大量的能量，宿主植物和固氮菌的呼吸反应需要消耗大量的氧气；而固氮酶对氧气又比较敏感，需要在低氧环境下才能保持较高的固氮效率；固氮酶与氧浓度之间这一平衡被称为“氧悖论”。
根瘤细胞可以合成大量的共生豆血红蛋白（LgHbs）来调节氧浓度，LgHbs由血红素和蛋白质组成，其中的血红素可以与氧气结合以降低氧浓度，需要时也可以将所结合的氧气释放以满足呼吸反应的需求。由于LgHbs的含量和组分直接影响根瘤内固氮酶的活性，在豆科植物生物固氮中发挥关键作用，但是迄今为止有关根瘤内豆血红蛋白基因表达调控机制还尚无报道。
研究内容
NLP（NIN-LikeProtein）家族是植物特有的一类转录因子，它能够结合靶基因启动子中的特殊“元件”（硝酸盐响应元件，NitrateResponseElement，NRE）来激活下游基因的表达，参与调节植物氮代谢过程。
本研究发现，LgHbs启动子中存在独特的“双”NRE元件（dNREs），而NLP家族成员NLP2和NIN可以通过直接结合该元件以调控LgHbs的表达，NRE元件缺失会导致血红蛋白表达的显著下降。本研究表明，NLP-血红蛋白模块与缺氧生存的作用在根瘤中得以延续。本研究阐明了豆科植物固氮的新调控机制，也为提高豆科植物的固氮能力提供了理论基础。
研究结果
NIN和NLP2是在紫花苜蓿根瘤中表达的仅有的NLPs成员。结果显示，NLP2敲除的根上结瘤变小，相应地固氮能力下降（图C-D）。
图1
蒺藜苜蓿根瘤中NLP2的表达和nlp2结瘤表型
同时，nlp2突变体根瘤中LgHb表达和血红素含量降低（图B-C）。对培养与不同氮浓度的nlp2突变体进行表达谱分析，结果显示氮浓度影响基因表达（图D）。同时表达谱结果显示，nlp2突变体中LgHbs、血红素生物合成酶和硝酸盐转运蛋白基因表达显著下降（图E-F）。在nlp2突变体中表达NLP2启动子可以部分恢复缺陷表型（图G）。
图2
NLP2缺失降低了固氮、植物氮含量、LgHb和血红素水平
进一步分析显示，在nlp2突变体根瘤中表达量下降最明显的55个基因中，有28个基因的启动子中含有NLPs转录激活所需的硝酸盐响应元件(NREs)。在LgHb基因启动子中发现了两个部分重叠的NRE组成的dNREs（图A）。EMSA实验、烟草中的异源表达实验证实，NLP2和NIN蛋白可以与LgHb启动子中的dNRE结合并激活其表达（图C-F）。nlp2突变体中nin突变会导致根瘤中LgHb表达量进一步降低，表明NLP2和NIN对于根瘤中LgHbs的转录调控存在冗余。
图3
NLP2通过NRE元件直接调控LgHb表达
系统发育分析显示，NLP2的同源基因仅存在于豆科植物中，NIN存在于豆科植物和结瘤的非豆科植物中。从进化角度而言，暗示NLPs对血红素的调控是NIN在结瘤非豆科植物中募集的基础，其次是NLP2的募集，进而提高了LgHb在豆科植物根瘤中的表达。
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